ИФА (без задачи)

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это высокоточный лабораторный метод, который используют для поиска в биоматериале (обычно в крови) специфических антител или антигенов. Одним из ключевых элементов этого метода являются ИФА-планшеты, а сами результаты строго документируются в медицинских протоколах.

ИФА-планшеты — это небольшие пластиковые панели, чаще всегко из птолистирола, предназначенные для проведения реакции на 96 образцах одновременно . По сути, это 96 отдельных «пробирок» (лунок), объединенных в одной рамке. Планшет помещают в спектрофотометр (ридер), который просвечивает лунки и выдает первичные значения — оптическую плотность (ОП) . Лаборант строго фиксирует время реакции, так как цвет может меняться.

Значения оптической плотности переносятся в документ "ИФА-планшет", в котором производятся расчеты. Далее ИФА-планшет подписывается и создаются неподписанные результаты, которые далее уже можно отобрать  в свод.

Расчеты в ИФА планшете вычисляются по ключевым этапам анализа :

1. • 1. Фоновая коррекция: Вычитается значение «холостой» пробы (Blank) для устранения фонового шума 
     .

   • 2. Контроль качества: Система проверяет, укладываются ли показатели контрольных образцов в заданные пределы (действителен ли тест) .
     

   • 3. Расчет порога (Cut-off): Рассчитывается критическое значение оптической плотности, разделяющее положительные и отрицательные образцы .
     .

   • 4. Интерпретация: Программа автоматически сравнивает значения образцов с пороговым (Cut-off) и выдает результат: «Положительно» или «Отрицательно» .

   • 
     5. Валидация и отчет: Программа строит калибровочные кривые и рассчитывает коэффициенты вариации (CV) для контроля точности дозирования .

    

1. 
   
   Этапы работы с документом ИФА-планшет:

   1. Настройка методики

2. 
   2. Настройка передачи данных с фотометра
3. 
   3. Создание документа и заполнение результатов
   4. Создание свода с подготовленными результатами и подписание готовых протоколов

1. Настройка методики

Методика для ИФА-планшета — это строго регламентированный, пошаговый алгоритм (протокол), который описывает, как именно нужно поставить иммуноферментный анализ, чтобы получить достоверный результат.  Заполняется по методическим указаниям производителя реагентов. 

Для открытия справочника методик:
Справочники - Лаборатория - ИФА - ИФА-методики

Откроется справочник ИФА-методики:

Выбрав нужную методику, необходимо произвести её настройки, нажав на значок редактировать или открыв методику двойным щелчком левой кнопкой мыши:

Далее обязательно нужно указать:
1. Основные настройки:

Рисунок :
1) Выбрать из справочника анализ, который проводится с использованием данной методики - указывается в качестве значения по умолчанию для подстановки в документ «ИФА-планшет», чтобы не выбирать каждый раз при создании документа вручную) Рис. (1)

2) Указать длину волны основного фильтра Рис. (2)

3) Указать длину волны дополнительного фильтра (при наличии) Рис. (3)

4) Указать количество лунок, используемых для каждого пациента (2, если исследование проводится «в дублях») Рис. (4)

5) Указать, с какой лунки начинаются измерения пациентов (следующая лунка после контроля), в примере это лунка A2 Рис. (5)

2. Вкладка "Стандарты"

• Добавить необходимое количество калибровочных проб, с указанием соответствующих значений концентраций исследуемого вещества (номер точки редактировать без необходимости не нужно. Отсчёт начинается с «0»)

Калибровочные пробы (калибраторы) — это серия растворов с точно известной концентрацией определяемого вещества (антитела или антигена), входящая в состав набора реагентов для количественного иммуноферментного анализа (ИФА). Они являются «линейкой», с помощью которой измеряют концентрацию неизвестного образца

• Выбрать алгоритм апроксимации для построения калибровочной кривой
  

Алгоритм аппроксимации — это метод, который позволяет заменить сложную, неизвестную, или слишком «рваную» функцию на более простую и понятную, которая проходит рядом или близко к исходным данным
Методы отрисовки функции:

- Линейный -  соседние точки соединяются прямыми отрезками, ломаная линия
- Сплайн Акимы - метод по Хироши Акима, строит кривую, которая четко проходит через все заданные точки, но без резких пиков там, где их не было в данных.
- Бикубический
 - catmull-romэто не одномерный метод (кривая), а метод для поверхности (2D), между четырьмя точками сетки он строит не линию, а кусок гладкой плоскости
- Catmull-Rom -  кривая проходит через все заданные точки (кроме, возможно, первой и последней), создавая очень мягкие, естественные изгибы, не делая жестких углов
- Линейная регрессия - построение одной прямой линии, которая будет максимально близка ко всем точкам одновременно (минимизирует сумму квадратов отклонений).
- Универсальный полином - полиномиальная аппроксимация — это метод, который описывает набор данных (точек на графике) с помощью единого уравнения многочлена (полинома) вида:
y = a + b·x + c·x² + d·x³ + ... Вместо того чтобы соединять точки прямыми линиями (ломаная) или искать сложную кривую по частям (сплайны), вы подбираете один многочлен, кривая которого проходит максимально близко ко всем точкам сразу.
- МНК - метод наименьших квадратов, который находит такие числа (коэффициенты), чтобы сумма квадратов отклонений между реальными точками и расчетной линией (или кривой) была минимальной
-по 4 точкам
-/по 5 точкам - это частные случаи универсального/полиномиального МНК, где уравнение подбирается не для всего графика разом, а скользящим окном. Алгоритм берет 4 (или 5) соседних точек, строит по ним кривую, двигается дальше.

3. Вкладка "Настройки для ИФА"
При построении планшета можно использовать разный тип плашки, по умолчанию используется стандартный, но если планшет не стандартный, можно выбрать из справочника "Типы плашек ИФА":

Если методика предполагает экстраполирование - прогнозирование значения за пределами данных калибровочных проб, на вкладке «Настройка для ИФА» можно включить данную функцию.

В строгих количественных тестах экстраполяцию не используют, а просто разбавляют пробу, чтобы завести ее в известные границы.

4. Вкладка "Планшет":

• На вкладке «Планшет» нажать кнопку «Создать по вертикали». Создастся таблица с нужным количеством лунок. 

  Если планшет не стандартный, то на вкладке «Настройка для ИФА» нужно выбрать тип планшета, после чего нажать кнопку «Создать по вертикали».

• В созданной таблице проверить корректность заполнения (количество лунок для пациента, и стартовую лунку). В примере исследование производится в дублях, и учитывая бланк, калибраторы и контроль, стартовая лунка – А2. (Рисунок 6). Так же в столбце выбор константы необходимо установить соответствие констант. Если необходимо видеть измеренное значение контроля, то в строке контроля нужно поставить произвольный номер результата, который не пересекается с номерами результатов пациентов (например 100)
• В первой строке таблицы указать анализ и параметр, который измеряется в этом планшете. Затем нажать кнопку «Скопировать первый» для заполнения всего планшета по примеру первой строки.

5. Вкладка "Описание констант"

Необходимо указать целевое значение контроля - допустимый диапазон значений, который служит критерием пригодности (валидности) анализа:

2. Настройка передачи данных с фотометра

Справочники – Лаборатория – Мед. оборудование – Реестр медицинского оборудования

В открывшемся справочнике выбрать оборудование, для которого необходимо настроить передачу и нажать кнопку "редактировать":

В открывшейся карточке анализатора необходимо установить галочки «Используется ЛПУ», «Фотометр» и указать номер COM-порта, по которому осуществляется обмен информацией с прибором:

3. Создание документа и заполнение результатов

Для того, чтобы создать документ «ИФА-планшет», с указанием проводимого исследования, используемой методики, прибора и направлений на исследование, перейдите:

Документы – Лаборатория – ИФА-планшеты

В открывшемся справочнике, для заполнения нового планшета, необходимо создать новый документ. Для редактирования или просмотра уже выполненного – открыть сохранённый документ

В новом документе необходимо выбрать методику. Анализ, длина волны фильтра, тип плашки, и маркировка лунок настроится автоматически по выбранной методике, но при необходимости эти значения можно редактировать.

После подготовки планшета, и проведённых исследований на ридере, необходимо нажать кнопку «Запуск»:

Измеренная оптическая плотность с ридера передастся в программу. Вкладки «Значения», «OD», и «Среднее».

• Вкладка «Значения» - чистые значения оптической плотности, полученные с ридера:

Если у прибора два фильтра, то в этой вкладке будет 2 таблицы с оптическими плотностями.

• На вкладке «OD» - рассчётная оптическая плотность, в случае если фильтров более одного. Если фильтр один, то значения с этой вкладки будут совпадать со значениями вкладки «Значения».
• На вкладке «Средние» значения оптической плотности за вычетом оптической плотности пустой лунки (бланка) - пустой лунки, по умолчанию ячейка А1
  
  OD (образца) = OD (сырая измеренная) — OD (бланка)
  

• На вкладке «График» находится калибровочная кривая. Для экономии ресурсов компьютера и времени, график строится «по точкам».
• На вкладке «Результат по формулам» в каждой лунке находится значение концентрации измеряемого вещества.
• На вкладке «Направление/пациент» необходимо указать соответствие лунки и направления. Выбрать нужную лунку, выбрать направление из списка, нажать кнопку «Добавить». (Рисунок 10)

Направления в списке отбираются по анализу, который указан как в верхней части документа. Туда он подставляется из методики.

4. Создание свода с подготовленными результатами и подписание готовых протоколов